近年来，细胞免疫疗法，特别是嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法和T细胞工程化受体T细胞（TCR-T）疗法，在血液系统恶性肿瘤的治疗领域内取得了显著突破。然而，在实体瘤的治疗应用上，这些疗法仍面临重重挑战，迫切需要对其作用机制进行更为深入的探索，以优化治疗方案的设计。

单细胞分析技术的兴起为揭示生物系统的复杂性提供了前所未有的契机，但该技术主要局限于捕捉细胞活动的静态快照，难以全面解析细胞功能中的动态行为特征。患者来源的类器官（PDO）作为一种新兴的研究工具，能够保留原始肿瘤的关键特征，包括患者特异性的治疗反应，已成为模拟免疫治疗功能的重要体外模型。

此外，三维成像技术的引入为研究免疫细胞与PDO之间的相互作用开辟了全新的视角，使研究者能够以更为直观的三维方式观察细胞组织及其动态变化。然而，这一技术目前尚未被深入应用于研究细胞免疫疗法在实体瘤中的动态靶向机制。

鉴于此，本研究将PDO与三维成像技术相结合，并整合转录组分析，创新性地开发了BEHAV3D平台。该平台旨在深入剖析表达γδ TCR的工程化αβ T细胞（TEGs）在实体瘤中的动态靶向策略，以期为个性化治疗的优化提供新的理论见解和技术支持。

2.1 BEHAV3D平台的搭建与效能验证

BEHAV3D平台由多光谱三维实时成像、图像处理与数据挖掘和单细胞转录组测序模块整合而成，可实现对超过15万个工程化T细胞的实时追踪。对TEGs与乳腺癌PDO共培养体系的检测结果显示，TEGs对PDO的杀伤效果在不同患者PDO之间，以及同一患者的不同PDO之间均存在显著差异。

单细胞测序结果显示，对TEGs具有不同敏感性的PDO之间观察到与炎症相关的基因和信号通路的显著差异，进一步说明PDO保留了肿瘤特异性的炎症特征，同时验证了PDO在个体化免疫疗法中的应用潜力。

△ BEHAV3D平台的工作流程以及TEGs与PDO共培养体系

2.2 TEGs行为分析及不同T细胞疗法评估

根据单个免疫细胞的行为追踪结果，研究团队识别出TEGs的九种行为模式，包括“静止”、“懒惰”、“缓慢扫描”、“中速扫描”、“快速扫描”、“轻触者”、“接触者”、“超级接触者”和“濒死”。其中“超级接触者”表现出最强的连续杀伤能力。

利用该平台，团队还评估了WT1-T细胞和CAR-T细胞疗法对于乳腺癌PDO的杀伤效果，结果显示，这两种细胞均表现出与TEGs一致的九种行为模式。其中，CAR-T细胞群体中具有活跃行为的细胞比例更高，诱导产生了更高的肿瘤细胞死亡率，相较于WT1-T细胞和TEGs具有更显著的杀伤效果。

△ PDO共培养条件下的TEGs行为分析和杀伤效果评估

2.3 TEGs的独特靶向和连续杀伤能力探索

为研究肿瘤靶向行为与群体表型的关联，研究团队重点分析了乳腺癌PDO共培养体系中CD4+和CD8+ TEGs的特征。

结果显示，相比于CD4+ TEGs，CD8+ TEGs具备更强的持续杀伤能力。通过BEHAV3D平台观察到，CD8+ TEGs表现出更高的连续杀伤潜力。单细胞RNA测序结果显示，CD8+ TEGs中神经细胞黏附分子1（NCAM1）的表达水平显著高于CD4+ TEGs。

进一步的分析结果显示，NCAM1+ CD8+ TEGs呈现出更显著的 “超级接触者” 行为特征，对乳腺癌PDO的杀伤能力更强。

△ TEGs亚群的区分和持续杀伤能力的评估

2.4 TEGs的行为转录组学分析

研究团队通过单细胞转录组分析，探讨了TEGs在肿瘤暴露、互动及杀伤过程中转录谱的动态变化。结果显示，与无靶标的对照细胞相比，效应CD8+（CD8+eff）TEGs、效应CD4+ （CD4+eff）TEGs和记忆CD4+ TEGs在与乳腺癌PDO共培养后，转录组均发生显著改变。

通过更深入的行为转录组学分析，研究团队发现了一组主要在CD8+eff TEGs和部分CD4+eff TEGs中表达的基因，这些基因与TEGs表现出的持续肿瘤细胞杀伤能力密切相关，为深入理解T细胞功能及其在肿瘤免疫治疗中的作用机制提供了关键线索。

△ TEGs在不同行为下的基因分布及表达特征

2.5  I型干扰素（IFN-I）信号通路促进TEGs的抗肿瘤疗效

研究团队通过分析TEGs与不同乳腺癌患者PDO共培养时的基因表达模式及其抗肿瘤效果，发现与高敏感性和中等敏感性乳腺癌PDO共培养的TEGs在基因表达上存在显著差异，特别是在免疫应答信号和抗病毒信号的激活上表现出了明显的不同。

同时，研究团队对高敏感性乳腺癌PDO分泌大量干扰素-β（IFN-β）的这一现象，展开了深入的机制探索，结果显示，IFN-β参与调控IFN-I信号通路，从而介导TEGs从“静止”到“扫描行为”的行为转变，而非直接影响其杀伤功能。但通过IFN-β预处理PDO，可显著增强其对TEGs的敏感性，从而间接提高TEGs的抗肿瘤效果。

△ TEGs共培养对乳腺癌PDO中IFN-I信号通路的影响

研究团队结合3D成像技术和转录组学分析，开发了BEHAV3D平台，为免疫细胞疗法攻克实体瘤提供了强有力的技术支持。本文研究不仅证实了BEHAV3D平台在增强患者来源的肿瘤组织（PDO）治疗肿瘤的潜力，还突显了其在推动实体瘤免疫疗法快速向临床应用转化中的重要价值。

● 探索细胞免疫治疗作用机制的新工具：研究团队创新性地开发了BEHAV3D平台，为深入解析免疫细胞治疗的作用机制提供了全新研究平台。

● 个体化免疫治疗策略的优化：研究团队通过免疫细胞行为和转录组数据，为优化患者特异性细胞治疗设计提供了支持。

● 增强疗效的联合策略的提出：研究探索并验证了IFN-β能增强PDO对T细胞治疗的敏感性，为实体瘤联合治疗方案设计提供了新思路。

参考文献：

Dekkers JF., et al. Uncovering the mode of action of engineered T cells in patient cancer organoids. Nat Biotechnol. 2023. 41(1):60-69. DOI:10.1038/s41587-022-01397-w. PMID: 35879361.